如何通过棋盘滴定法确定ELISA最佳浓度

确定ELISA最佳浓度，棋盘滴定法是最经典可靠的方法。它的核心是通过系统测试不同抗原和抗体浓度的组合，找到信号强、背景低的最佳配比。

‌具体操作步骤如下：‌

‌包被抗体稀释‌：将包被抗体用包被缓冲液进行系列稀释（如1:100、1:200、1:400等），加入酶标板孔中，每孔100μL，4℃孵育过夜或37℃孵育2-3小时。
‌封闭‌：弃去孔内液体，用洗涤液洗涤3-5次，拍干后加入封闭液，每孔200μL，37℃孵育1-2小时。
‌抗原稀释‌：将已知浓度的标准抗原用稀释液进行系列稀释（如1:50、1:100、1:200等），加入各包被浓度对应的孔中，同时设阴性对照孔，每孔100μL，37℃孵育1-2小时。
‌加检测抗体‌：洗涤后加入酶标记的检测抗体，每孔100μL，37℃孵育1小时。
‌显色与终止‌：洗涤后加入显色液，37℃避光孵育15-30分钟，加入终止液终止反应。
‌读数‌：用酶标仪在特定波长下测定各孔OD值，选择OD值在1.0-2.0（或处于标准曲线线性范围内且信号较强、背景较低）对应的包被抗体浓度和抗原浓度作为最佳工作浓度。
‌结果判定‌：

最佳包被浓度：阳性血清区域内某个孔对应的OD值与其上/其左孔OD值恰好为2倍关系且OD值不低于1.2，且此孔对应的阴性血清区域OD值与空白对照孔OD值无差异，此孔包被的抗原浓度的2倍确定为抗原的最佳包被浓度。
最佳抗体稀释度：OD值在1.0左右时的稀释度。
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常见误区‌：

‌浓度越高越好‌：浓度过高可能导致非特异性结合，背景升高，甚至出现“钩状效应”。
‌完全依赖说明书‌：说明书上的稀释比例是参考范围，不同批次抗体的效价和活性可能有差异，需通过预实验优化。
‌忽视抗体保存‌：反复冻融会导致抗体变性失活，应分装保存，避免反复冻融。
‌稀释操作不规范‌：移取极少量原液或多次倍比稀释可能导致误差，建议使用校准过的移液器，采用直接稀释法，并确保充分混匀。
‌不进行预实验‌：跳过预实验直接使用“经验浓度”是常见误区，务必通过预实验确定最佳工作浓度。
‌注意事项‌：

需设置阴性对照和空白对照以排除非特异性结合。
洗涤步骤要彻底，避免残留干扰结果。
若出现钩状效应（高浓度抗原导致假阴性），需对抗原进行更高倍稀释。
通过上述方法，可精确确定抗原抗体的最佳工作浓度，为后续ELISA检测奠定基础。