免疫PCR主要由两个部分组成

  免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验（ELISA）的测定过程；第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原（如牛血清白蛋白（ESA））包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素（Protein A-Streptavidin）嵌合体（重组融合蛋白）中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19（质粒DNA) (Biotin-pUC19）中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。

实验步骤

一、制备生物素化DNA

将噬粒 BLuescript skt，用生物素标记的M13引物进行PCR扩增制备出含T3和T7引物序列的280 bp DNa段，即为生物素化DNA。

二、免疫PCR模式

1.  试剂

包被缓冲液：20 mmol/L Tris-HCI（pH9.5），含150 mmol/L NaCl和0.02%NaN3；

洗涤液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/LNaCl 0.1 mmol/L EDTA和0.1%Tween20；

稀释液：20 mmol/L Tris-HCI（pH7.5），含150 mmol/L NaCl 0.45%脱脂奶及变性鲑鱼精DNA （0.1 mg/ml）。

2.  操作

（1） 包被

用包被缓冲液稀释抗原（BSA），加入微滴板中（45 μl孔），4℃过夜（约15 h），用洗涤液洗板3次×5 min。

（2） 封闭

每孔加200 μl含4.5%脱脂奶及变性鲑鱼精子DNA（1 mg/ml）、0.1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-Hcl（pH7.5）（含150 mmol/L NaCl缓冲液，37℃温育80 min，洗板数次。

（3） 抗原抗体反应

用释释液1:8 000稀释单克隆抗BSA抗体，每孔加50 μl，室温（22℃）下45 min，洗板孔15次×10 min，去除未结合的抗体分子。

（4） 链亲合一蛋白A结合反应

每孔加入50 μl用稀释液稀释的已与生物素-pUC19结合的链亲合素-蛋白A嵌合体，室温（22℃）50 min，使得嵌合体-pUC19结合于固相的抗原抗体复合物上，然后洗板15次×10 min，再用无NaN3的TBS洗3次，然后即可将微滴板用于后面的PCR反应。

（5） PCR

实验条件 50 mmol/L KCI、10 mmol/L Tris-HCI（20℃pH8.3）、1.5 mmol/LMgCl2、明胶（10 μg/ml）、0.8 mmol/LdNTPs（每种0.2 mM）、2 μM引物（每一引物1 μM）和TaqDNA多聚酶（50 U/ml）。