柱式病毒RNA提取试剂盒使用步骤

柱式病毒RNA提取试剂盒使用步骤：

1. 如果有 N 个样品，标记 N+2 个 1.5-2 mL 螺旋盖塑料离心管，多出的一个为阳性对照，一个为阴性 对照。为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。在每个管上做 个标记，以在后续操作时区别向心面和离心面。然后各加入 0.2 mL 液体样品（血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液、眼泪等等）。

1.1、 如果是口腔拭子、咽喉拭子等各种拭子样品，则将拭子放入 0.2mL 自备生理盐水中挤压出液体，然后取 0.2mL 进行提取。

1.2、 如果是粪便等半固定样品，则取约 0.3mL 的样品，加入 0,3 自备生理盐水，震荡重悬，离心取 0.2mL 上清进行提取。

1.3、 如果血液，细胞培养液等含细胞的液体，可以离心用上清，也可以直接取用，但后者提取的 RNA 中有细胞的基因组 DNA 污 染。血浆的抗凝剂必须是 EDTA 或 ACD，不能是肝素。使用 ACD 时由于所加入 ACD 会增加体积，样品会被稀释，得到的 病毒滴度会比使用 EDTA 低 15%左右。血浆按 0.6mL/ 管的量分装保存，以避免反复冻融。

1.4、 如果样品是实体组织或培养细胞，则需要在自备生理盐水中匀浆后离心，用 0.2mL 上清液（含病毒）进行提取，但此种情 况下最后得到的 RNA 不可避免的会含有基因组 DNA 污染。

1.5、 如果液体样品中的病毒需要富集，可以使用 1.5 mL 上述方法得到的液体在 4℃ 24,000 g 冷冻离心 60 分钟, 移弃 1.3 mL、 用剩下的 0.2mL 继续操作。 

2. 加入 0.6 mL RNA 病毒裂解液，振荡 30 秒混匀后室温放置 10 分钟。 注意：RNA 病毒裂解液在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。

3. 加入 0.8mL 上柱结合液到离心管中，颠倒混匀后转移一半的混合液 （0.8 mL）到离心吸附柱中，室温放置 2 分钟。

4. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱 放回到收集管中。

5. 将剩余的另外一半裂解液（0.8mL）转移到离心吸附柱中，室温放置 2 分钟。

6. 12,000 rpm 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱 放回到收集管中。

7. 加入 0.7 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000 rmp 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。

8. 加入 0.3 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，12,000 rmp 室温离心 1 分钟，弃收集管中的穿透液，把离心吸附柱放回到收集管中。此为第 二次洗涤，可以跳过。

9. 12000 g 室温离心半分钟。

10. 在离心吸附柱的滤膜的中部加入 30-100 uL RNA 洗脱液，然后将离心吸附柱套入一新的 1.5 mL 离心管中，室温放置 2 分钟。

11. 12000 g 室温离心 1 分钟，离心管中收集的样品即为 RNA。

12. RNA 样品可以直接用于 RT-PCR 或逆转录反应，也可放-80℃长期保存。