大鼠大脑皮层神经元细胞培养作用

     大鼠大脑皮层神经元细胞培养可以：（1）获得大鼠大脑皮层神经元细胞；（2）用于神经元细胞定向分化研究；（3）用于神经元细胞凋亡研究。

一、实验步骤

1. 孕16 d SD 大鼠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的 D-Hanks’平衡盐液中。

2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。

4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的 DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤 2～3 次。

5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。

6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成单细胞悬液。

7. 细胞计数，调整细胞密度按1.5×105/cm2  种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。培养48 h 后换液并 加入Ara-C使其终浓度为 1×10-5 mM/L。Ara-C作用24 h 后全量换液。以后每隔 3 天半量换液一次。

注意事项：

1. 上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动：如消化时可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右，也可用 DNA 酶进行消化，有人还直接进行吹打，都可行。

2. 上面虽然时大鼠皮层神经元，但是同样适用于小鼠，但是应该选择孕13 d 左右的小鼠。

3. 神经元是一种比较难培养的细胞，因此在接种时细胞的密度一定要够。