如何进行人表皮角质形成细胞的传代培养？

1如何进行人表皮角质形成细胞的传代培养？
问＆答-------------------------------------------
皮肤不但是人体的生理屏障，而且在机体免疫和内分泌等方面起着极其重要的作用。角质形成细胞是表皮细胞的主要组成部分，角质形成细胞的体外培养可为皮肤毒理学、烧伤治疗学、美容学和皮肤病发病机制的研究提供新的途径。那么该如何进行人表皮角质形成细胞的传代培养？
1.达到60%～75%的融合后，移去培养基，单层细胞使用10ml 1：5000乙二胺四乙酸(Versene)冲洗。1～2ml0.05%胰蛋白酶-0.53m M EDTA加入培养瓶中在36°C ± 2°C孵育5-10分钟。当细胞开始变圆时，移除胰蛋白酶，在36°C ± 2°C再次孵育。
2.当大约90%细胞分离时，使用10ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶活性。细胞悬液转移到15ml无菌离心管，在室温下40g离心5分钟。细胞重新制成悬液并按上述方法再次离心。
3.角质形成细胞使用3～5ml完全培养基轻柔的吹打成悬液，细胞大约1～3×106 放入75cm2组织培养瓶中，并加入15ml完全培养基。
4.细胞培养： 36°C ± 2°C，5% CO2的空气中。角质形成细胞培养液约每2～3天更换一次，当达到60%～75%融合后，即可进行传代。

2进行细胞冻存时，该注意些什么？
问＆答-------------------------------------------
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法。其方法是将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样只要在需要的时候再复苏细胞就可用于实验。进行细胞冻存时，该注意些什么？
(1)细胞在冷冻过程中在-20℃冰箱内放置时间不可超过1 小时，以防止冰晶过大而破坏细胞。也可跳过-20℃这一步骤直接放入-80℃冰箱中，但这样做细胞存活率要低一些。
(2)DMSO稀释时会释放大量热量。因此，DMSO 不能直接加到细胞液中，必须事先配制。
(3)DMSO必须是细胞培养级别的。新买的DMSO 本身处于无菌状态，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管或瓶中，4℃保存。避免反复冻融造成DMSO 裂解产生有害物质。并可减少污染机会。如要过滤DMSO，必须选用耐DMSO 的尼龙滤膜(millipore)。细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂，基础培养液，血清或蛋白。

3细菌、支原体等微生物污染在细胞培养中有哪些特点？
问＆答-------------------------------------------
细胞培养中的微生物污染种类可分成细菌、支原体、真菌和病毒污染。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之胎牛血清和污染之细胞等。细菌、支原体等微生物污染在细胞培养中有哪些特点？
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
3、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
4、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
那么确定细胞受到哪种微生物污染之后，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

4配制干粉培养基时，该注意什么?
问＆答-------------------------------------------
现在，市面上卖的大部分是液体培养基，但还是有少部分的干粉培养基。相对液态培养基，干粉培养基的优势在于，生产成本低，便于运输，可以长期保存。可是它不能直接使用，需要将它配制成液体培养基。配制干粉培养基时，该注意什么?
1.干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
2.配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。
3.配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。
4.所用器皿应严格消毒。
5.配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。
6.液体培养基主要是为了科研工作的方便而设计的培养基，它是一种灭菌后保证无菌的溶液，必要时可制成无内毒素等的溶液，可节省科研人员的工作量。

5实验到什么时候即可以进行ES/iPS细胞的传代？
问＆答-------------------------------------------
目前，医学界最热门的莫过于干细胞疗法。这是因为干细胞具有增殖和分化的潜能，其可在一定条件下，分化成人们所需要的细胞，医学界称之为“万能细胞”。那么，实验到什么时候即可以进行ES/iPS细胞的传代？当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：
1.MEF滋养层细胞生长超过两周。
2.克隆太大，或太密集。
3.当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。

6进行单核细胞（monocytes）分离时的实验要点是什么？
问＆答-------------------------------------------
        单核细胞(monocytes)是体内一类重要的无颗粒白细胞，来源于骨髓造血干细胞，成熟的单核细胞被释放入血液，构成约5%-10%的外周血白细胞。进行单核细胞（monocytes）分离时的实验要点是什么？
1.为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。
2.所有操作过程应在18-20℃中进行。
3.仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。
4.洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。
5.如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

7对新生Wistar大鼠海马神经元进行原代培养时，要注意些什么？
问＆答-------------------------------------------
        海马属于大脑的边缘系统，是比较古老的皮质结构，在学习、近期记忆、情绪及内脏功能调节当方面中发挥至关重要作用。大脑海马部位的神经元高度聚集，会对多种致病因素比较敏感，是癫痫、阿尔茨海默病等神经系统疾病容易发作的部位之一。在体外，成功进行海马神经元的原代培养能够为探讨神经系统疾病的发病机制及筛选神经保护性药物提供良好的实验平台。对新生Wistar大鼠海马神经元进行原代培养时，要注意些什么？
1.分离组织要迅速，尽量减少操作时间。因用Optiprep介质离心时可分离血细胞，分离组织时可不必过细的剔除血点。
2.用于分离组织的液体不能偏碱，会明显影响细胞状态。
3.消化后的组织会释放DNA，导致组织粘稠无法吹开，DNAase可以有效缓解此现象，若发现在上述DNAase量下仍有粘稠，可适当增加DNAase量。粘稠的物质在过筛时无法筛掉，种板后会很快黏至板底，洗板时无法洗掉，其周围很大面积内没有细胞，严重影响实验成败。
4.种板时细胞密度至少在1×106/孔(6孔板)，过稀细胞无法生长。
5.细胞贴壁6小时后及时洗板，时间长后碎片不易洗掉，影响细胞生长。