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公司新闻
蛋白样品制备
发布时间：2017-06-26 09:25 | 点击次数：351
制备是蛋白质组分析的第一步也是关键的一步。
细胞的破碎是蛋白组样品准备的第一步。细胞破碎的方法包括机械方法(如玻璃匀浆与机械匀浆)、超声波破碎、压力破碎、反复冻融、渗透压破碎及去垢剂裂解(NP-40 等)。在所有的方法中，去垢剂裂解可以产生最完全的细胞裂解，因此可以获得最好的蛋白回收率。尤其是对于膜蛋白来说，去垢剂有助溶的作用，因而能够较好地将膜蛋白提取出来。但是，去垢剂对于后续的质谱分析具有较大的负面影响，产生很高的污染质谱信号而干扰多肽的检出。
因此去垢剂裂解后的蛋白质需要进行较为彻底的去垢剂处理。通常，裂解后的蛋白质需要多次重复进行丙酮沉淀洗涤，以尽可能除去去垢剂。尽管近年来也发展出诸如离心柱等除去垢剂方法，丙酮沉淀洗涤依然是方便可靠的常用方法。较传统的细胞裂解还包括尿素裂解，一般用9M尿素溶液，辅以CHAPS和DTT等。这个配方的独特优势是尿素产生的强变性条件有助于提取富脂类样品，如神经组织或其他组织样品中的蛋白质。
和基因组的稳定均一以及在每个细胞内分布一致的特点不同，蛋白质组在不同细胞中的分布呈现细胞特异性以及丰度的不均一性。不同蛋白质在细胞内的丰度不均一性是质谱样品准备面临的最大挑战。高丰度的蛋白质在细胞中通常达到百万拷贝，其存在通常会屏蔽低丰度蛋白质(通常只有 10 个左右拷贝)的检出。
因此在样品准备过程中，包括白蛋自在内的高丰度蛋白质最好能够被部分移除。包括丙酮梯度沉淀等方法被证明可以较为有效地移除总蛋白里面的白蛋白等高丰度蛋白，但是完全特异的高丰度蛋白质的去除目前是蛋白质组学研究中没有解决的技术难题。
样品制备中还存在一些普遍性的问题。如，普通样品制备方法制备的蛋白质组样品通常较难溶于溶液。其中部分原因是在样品制备过程中形成了二硫键等以及其他的弱相互作用。在制备的蛋白中加入还原剂 DTT 是样品制各中常采用的方法。但是，DTT 的加入并不能完全保证断裂的二硫键不重新连接。为了彻底消除二硫键的形成，碘乙酰胺有时被用来氧化巯基，以彻底消除二硫键的存在。
细胞的破碎是蛋白组样品准备的第一步。细胞破碎的方法包括机械方法(如玻璃匀浆与机械匀浆)、超声波破碎、压力破碎、反复冻融、渗透压破碎及去垢剂裂解(NP-40 等)。在所有的方法中，去垢剂裂解可以产生最完全的细胞裂解，因此可以获得最好的蛋白回收率。尤其是对于膜蛋白来说，去垢剂有助溶的作用，因而能够较好地将膜蛋白提取出来。但是，去垢剂对于后续的质谱分析具有较大的负面影响，产生很高的污染质谱信号而干扰多肽的检出。
因此去垢剂裂解后的蛋白质需要进行较为彻底的去垢剂处理。通常，裂解后的蛋白质需要多次重复进行丙酮沉淀洗涤，以尽可能除去去垢剂。尽管近年来也发展出诸如离心柱等除去垢剂方法，丙酮沉淀洗涤依然是方便可靠的常用方法。较传统的细胞裂解还包括尿素裂解，一般用9M尿素溶液，辅以CHAPS和DTT等。这个配方的独特优势是尿素产生的强变性条件有助于提取富脂类样品，如神经组织或其他组织样品中的蛋白质。
和基因组的稳定均一以及在每个细胞内分布一致的特点不同，蛋白质组在不同细胞中的分布呈现细胞特异性以及丰度的不均一性。不同蛋白质在细胞内的丰度不均一性是质谱样品准备面临的最大挑战。高丰度的蛋白质在细胞中通常达到百万拷贝，其存在通常会屏蔽低丰度蛋白质(通常只有 10 个左右拷贝)的检出。
因此在样品准备过程中，包括白蛋自在内的高丰度蛋白质最好能够被部分移除。包括丙酮梯度沉淀等方法被证明可以较为有效地移除总蛋白里面的白蛋白等高丰度蛋白，但是完全特异的高丰度蛋白质的去除目前是蛋白质组学研究中没有解决的技术难题。
样品制备中还存在一些普遍性的问题。如，普通样品制备方法制备的蛋白质组样品通常较难溶于溶液。其中部分原因是在样品制备过程中形成了二硫键等以及其他的弱相互作用。在制备的蛋白中加入还原剂 DTT 是样品制各中常采用的方法。但是，DTT 的加入并不能完全保证断裂的二硫键不重新连接。为了彻底消除二硫键的形成，碘乙酰胺有时被用来氧化巯基，以彻底消除二硫键的存在。